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食用色素按其来源可分为食用天然色素和食用合成色素两大类。食用色素食用天然色素是人工从有色的动、植物体内提取，合成经进一步分离精制而成。测定合成色素因其着色力强，食用色素易于调色，人工在食品加工过程中稳定性能好，合成价格低廉，测定在食用色素中占主要地位。食用色素目前，人工国内外使用的合成食用色素绝大多数都是食用合成色素。合成色素主要来源于煤焦油及其副产品，测定且在合成过譬皇?食用色素能受铅、砷等有害物质污染，人工因此在使用的合成安全性上，其争论要比其他类的食品添加型要岁突出和尖锐。中国许可使用的合成色素有9种：苋菜红、胭脂红、诱惑红、新红、柠檬黄、日落黄、靛蓝、亮蓝、赤藓红。前6种为偶氮类化合物，使用中占绝大多数。食用合成色毒的测定方法主要有薄层色谱法和高效液相色谱法。下面介绍高效液相色谱法测定食用合成着色剂。

1、原理

食品中人工合成着色剂用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性，与峰面积比较进行定量。

2、试剂

①盐酸。

②乙酸。

③正己烷。

④甲醇：经滤膜(O.5μm)过滤。

⑤酰胺粉(尼龙6)：过200目筛。

⑥乙酸铵溶液0.02m01/L。称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL溶解，经0.45μm滤膜过滤。

⑦水取2mL氨水，加水至100mL混匀。

⑧水一乙酸铵溶液0.02mol/L。取氨水0.5mL加乙酸铵溶液(O.02mot／L)至1000mL混匀。

⑨甲醇一甲酸溶液6+4。取甲醇60mL，甲酸40mL混匀。

⑩柠檬酸溶液：取20g柠檬酸(C₆H₈0₇·H₂0)加水至100mL，溶解混匀。

⑪无水乙醇-氨水-水溶液7+2+1。取无水乙醇70mL、氨水20mL、水lOmL混匀。

⑫三正辛胺正丁醇溶液 5％。取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL混匀。

⑬饱和硫酸钠溶液。

⑭硫酸钠溶液：2g／L。

⑮pH6的水水加柠檬酸溶液调pH6。

⑯合成着色剂标准溶液准确称取按其纯度折算为100％质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，置于lOOmL容量瓶中，加pH6的水到刻度，配成水溶液(1.00mg／mL)。

⑰合成着色剂标准使用液 临用时将上述溶液加水稀释20倍，经0.45μm滤膜过滤。配成每毫升相当于50.0μg的合成着色剂。

3、仪器

高效液相色谱仪，带紫外检测器，254nm波长。

4、操作方法

(1)样品处理

①橘子汁、果味水、果子露汽水等：称取20.O～40.Og放入100mL烧杯中。含二氧化碳样品加热驱除二氧化碳。

②配制酒类：称取20.0～40.0g放入100mL烧杯中，加入小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。

③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等：称取5.00～10.OOg，粉碎样品，放入100mL小烧杯中，加水30mL，温热溶解，若样品溶液pH较高，用柠檬酸溶液调pH至6左右。

④巧克力豆及着色糖衣制品：称取5.00～10.OOg，放入100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素，至巧克力豆无色素为止，合并色素漂洗液为样品溶液。

(2)色素提取

①聚酰胺吸附法：样品溶液加柠檬酸溶液调pH为6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G₃垂熔漏斗抽滤，用60℃pH 4的水洗涤3～5次，然后用甲醇一甲酸混合溶液洗涤3～5次(含赤藓红的样品用液一液分配法处理)。再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。经滤膜(O.45μm)过滤，取10μL进高效液相色谱仪。

②液-液分配法(适用于含赤藓红的样品)：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸、三正辛胺正丁醇溶液(5％)10～20mL，振摇提取，分取有机相，重复提取，直到有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸铵溶液洗两次，每次10mL，分取有机相，放蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL，转移至分液漏斗中，加60mL正己烷混匀，加氨水提取2～3次，每次5mL，合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗两次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL。经滤膜(0.45μm)过滤，取10μL进高效液相色谱仪。

(3)高效液相色谱参考条件

①色谱柱：YWG-C_l810μm不锈钢柱4.6mm(内径)×250mm。

②流动相：甲醇-O.02m01/L乙酸铵溶液(pH 4)。

③梯度洗脱：甲醇20％～35％，5min；35％～98％，5min；98％继续6min。

④流速：1mL/min。

⑤紫外检测器：254nm波长。

(4)测定:取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

5、结果计算式中：

X_i——样品中着色剂的含量，g/kg；

C_i——样液中着色剂的质量，μg；

V₂——进样体积，mL；

V₁——样品稀释总体积，mL；

m——样品质量，g。

6、说明

①最小检出量：新红5ng，柠檬黄4ng，苋菜红6ng，胭脂红26ng。

②允许相对误差≤10％。

③样品不含赤藓红时，用聚酰胺吸附法；含赤藓红时，用液-液分配法

④测定一个样品后，将甲醇流动相恢复至20％，使之稳定20min后，再开始测定第二个样品。

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